一、實驗技術(shù)及原理
運用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)、流式細(xì)胞術(shù)（體外擴(kuò)增后ACSs的表型會發(fā)生改變，主要體現(xiàn)在細(xì)胞表面蛋白和細(xì)胞因子表達(dá)的變化），差異離心術(shù)（可將基質(zhì)血管細(xì)胞沉淀與懸浮的成熟脂肪細(xì)胞分離，沉淀中除ASCs，還包括血細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，基質(zhì)血管細(xì)胞沉淀可以接種到孰料培養(yǎng)瓶中，基質(zhì)細(xì)胞可貼壁，造血和其他雜質(zhì)細(xì)胞不貼壁，在隨后的傳代過程中被出去，最終得到的ASCs可再很長時間內(nèi)保持摸分化狀態(tài)）。取C57BL／6 WT小鼠2只，常規(guī)麻醉消毒，取腹股溝脂肪組織剪碎至糊狀，PBS液沖洗去麻藥及血液，0.075%II型膠原酶消化（37℃，30分鐘）以去除外基質(zhì)，生理鹽水終止膠原酶的消化，離心（1 200 g，10分鐘），去上清液及未消化的脂肪，10%FBS的DMEM重懸細(xì)胞沉淀，0.16 mol/L氯化氨溶解剩余紅細(xì)胞，離心洗滌，過200目銅網(wǎng)，得到單個核細(xì)胞。鏡下計數(shù)，按104個細(xì)胞/ml種植在培養(yǎng)瓶中，37℃ 5%CO2孵箱培養(yǎng)，24小時后第一次換液，以后3天換液一次，80%融合后0.25% Trypsin，0.02%EDTA消化傳代。細(xì)胞鏡下作形態(tài)學(xué)觀察及取第三代細(xì)胞用流式細(xì)胞儀作細(xì)胞周期及細(xì)胞免疫表型（CD29/CD44）的鑒定。
二、實驗用品
1. 材料：C57BL／6 WT小鼠。
2. 試劑：PBS液，0.075%II型膠原酶消化，10%FBS，低糖DMEM。
3. 儀器設(shè)備：超凈工作臺、恒溫培養(yǎng)箱、普通顯微鏡、倒置顯微鏡、低速離心機(jī)、離心管、解剖剪、眼科剪、鑷子（尖頭、平頭和有溝鑷）、小燒杯，200目銅網(wǎng)過濾器，低糖DMEM、血球計數(shù)板、橡皮瓶塞、酒精燈、換藥碗。
脂肪干細(xì)胞的培養(yǎng)，分離，共培養(yǎng) ：
將吸脂來源的脂肪組織用D-Hanks 沖洗，去除殘留的血細(xì)胞和組織碎片，把脂肪組織放入離心管中，記錄原始體積。向組織中加入等體積的0.1%Ⅰ型膠原酶，放入37℃氣浴振蕩器中消化30 min。然后將消化好的組織靜置5 min，待其分層后，用吸管吸取位于懸液上層的脂肪細(xì)胞，將含有脂肪細(xì)胞的懸液以1000 r/min(167g)，離心2 min 后棄掉下層懸液得到脂肪細(xì)胞。
脂肪干細(xì)胞的分離和培養(yǎng)
參照文獻(xiàn)，同上述脂肪細(xì)胞的分離一樣，將脂肪組織沖凈，稱重后消化。當(dāng)消化完成后，棄掉上層未消化的脂肪組織，將下層的細(xì)胞懸液以1500 r/min(375g)，離心10 min 后棄上清，得到離心管底部的脂肪干細(xì)胞團(tuán)，將其重懸，密度調(diào)整到1×105mL-1，然后接種在培養(yǎng)面積為25 cm2 的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。
當(dāng)干細(xì)胞長滿培養(yǎng)瓶后按一傳二進(jìn)行傳代，具體的傳代方法是：首先，用D-Hanks 沖洗一遍細(xì)胞，然后加入2 mL 的混合酶溶液(0.25%胰酶和0.02%EDTA)消化，當(dāng)在顯微鏡下觀察到細(xì)胞發(fā)生明顯的變形，縮成球狀后，立即用含有10%胎牛血清的培養(yǎng)基中止消化，并用吸管輕輕吹打瓶底部，確保細(xì)胞完全脫落分離到懸液中，再把細(xì)胞懸液置于低速離心機(jī)上，以1000 r/min (167g)，離心5 min。最后，將離心得到的細(xì)胞團(tuán)重懸，調(diào)整密度為合適密度進(jìn)行接種。
脂肪干細(xì)胞和脂肪細(xì)胞的共培養(yǎng)
將準(zhǔn)備好的脂肪干細(xì)胞和脂肪細(xì)胞分別置于Transwell 的上室和下層中，脂肪干細(xì)胞與脂肪細(xì)胞的個數(shù)之比分別為1:5，1:1，2:1 和5:1(4 組分別命名為A、B、C 和D 組)進(jìn)行共培養(yǎng)，其中每孔中脂肪細(xì)胞的數(shù)量均為1×105 個。以上每組均做平行實驗(n=3)。
成脂誘導(dǎo)對照實驗
將干細(xì)胞以1.5×105 每孔的密度接種在六孔板中，以正常培養(yǎng)基培養(yǎng)的樣本為成脂分化實驗陰性對照組，以成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)的樣本為陽性對照組。具體方法是：向基礎(chǔ)培養(yǎng)基(DMEM+10%胎牛血清)中加入1 μmol/L 的地塞米松、10 μmol/L 的胰島素、200 μmol/L 的吲哚美辛和0.5 mmol/L 的異丁基甲基黃嘌呤，配制成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基，每周換2 次液，直到進(jìn)行成脂染色觀察為止，以上對照組均做平行實驗(n=3)。
油紅 O 和臺盼藍(lán)復(fù)合染色
用 0.5%油紅O，對成脂誘導(dǎo)后的各組樣本進(jìn)行染色。具體操作方法是：先用D-hanks將樣本細(xì)胞沖洗充分，然后加入油紅稀釋染色10~15 min，(油紅O 稀釋液配制方法:0.5%飽和油紅O 原液按3:2(油紅O:蒸餾水)加入蒸餾水，然后過濾，待用)，接下來用75%的乙醇溶液將樣本分化至間質(zhì)清晰，然后蒸餾水沖，最后再用臺盼藍(lán)對脂質(zhì)以外的細(xì)胞核部分進(jìn)行復(fù)染，并于100 倍鏡下觀察拍照。以每組樣本隨機(jī)選取5~10 視野進(jìn)行拍照觀察以考察共培養(yǎng)方法的成脂誘導(dǎo)分化效果。
掃我聯(lián)系